His標(biāo)簽（多組氨酸標(biāo)簽）是在變性條件下純化重組蛋白的常用方案。His標(biāo)簽蛋白純化技術(shù)因其標(biāo)簽分子量小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且對(duì)目標(biāo)蛋白功能、活性及構(gòu)象干擾極小等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用。該技術(shù)通過基因工程手段在目標(biāo)蛋白N端融合6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基（6×His），基于固定化金屬離子親和層析（IMAC）原理，使His標(biāo)簽與固定化鎳/鈷離子通過穩(wěn)定的配位鍵特異性結(jié)合。

固定化金屬離子親和層析（IMAC）是純化組氨酸標(biāo)簽蛋白的常規(guī)方法。該方法采用含有固定化金屬離子（如鈷離子，Co2?）的IMAC介質(zhì)，通過金屬離子與His標(biāo)簽的配位結(jié)合實(shí)現(xiàn)目的蛋白的捕獲。將介質(zhì)裝填至層析柱后，以低咪唑濃度緩沖液作為上樣緩沖液攜帶目標(biāo)蛋白。控制緩沖液以低流速緩慢流經(jīng)層析柱，使His標(biāo)簽蛋白與介質(zhì)中的Co2?充分結(jié)合。然后采用高咪唑濃度緩沖液通過競(jìng)爭(zhēng)性置換將目的蛋白洗脫回收。

這種方法通過在固定化金屬離子親和層析柱（IMAC column）中精確控制變性緩沖液（如含咪唑溶液）的體積與流速，可實(shí)現(xiàn)組氨酸標(biāo)簽蛋白的穩(wěn)定純化。純化過程的控制越精確，目標(biāo)蛋白在單次柱上操作中的回收率越高。采用可控且可重復(fù)的IMAC純化流程，研究人員可在最短時(shí)間內(nèi)獲得高純度、高活性的目標(biāo)蛋白。

應(yīng)用于His標(biāo)簽高效蛋白純化的理想注射泵解決方案

許多實(shí)驗(yàn)室致力于尋找一種經(jīng)濟(jì)高效的方法以實(shí)現(xiàn)高效的蛋白質(zhì)純化。一種便捷的方案是通過鈷重力柱以精確可控的方式輸送雙路獨(dú)立的咪唑緩沖液進(jìn)行可控洗脫，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)His標(biāo)簽蛋白的高效純化。針對(duì)該應(yīng)用的理想注射泵解決方案是通過I/O端口及內(nèi)置的編程功能，將兩臺(tái) Harvard Pump 11 Elite 可編程注射泵進(jìn)行聯(lián)用。此配置可構(gòu)建創(chuàng)新性的注射泵系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)兩臺(tái)注射泵獨(dú)立流速的同步控制。利用內(nèi)置的多步驟編程及輸入/輸出信號(hào)通信功能，所有操作均可通過Pump 11 Elite的觸控界面完成，無需外部編程或計(jì)算機(jī)支持（見圖1）。

圖1

注射泵A：控制一支 10 mL 氣密型注射器，用于將含有His標(biāo)簽蛋白的低咪唑濃度緩沖液以 1 mL/min 的流速注入重力柱，總體積為10 mL，持續(xù)10分鐘。精確控制流速對(duì)于確保His標(biāo)簽蛋白與柱內(nèi)鈷基IMAC介質(zhì)充分結(jié)合至關(guān)重要。 

注射泵 B：控制一支 10 mL 氣密型注射器，用于輸送高咪唑濃度緩沖液，用以將結(jié)合在鈷基親和層析介質(zhì)上的標(biāo)簽蛋白洗脫下來。

下一步操作要求 注射泵 A 進(jìn)入回抽模式以完成灌注。注射泵 A 向注射泵 B 發(fā)送信號(hào)，讓注射泵 B 通過其注射器吸入高咪唑濃度緩沖液。從注射模式切換至回抽模式所產(chǎn)生的壓力變化將觸發(fā)單向閥開啟，從而使兩臺(tái)泵均能充滿合適濃度的咪唑緩沖液。回抽過程需迅速但可控，以避免緩沖液發(fā)生脫氣現(xiàn)象。緩沖液一旦脫氣，將對(duì)重力柱中鈷基介質(zhì)上的蛋白純化反應(yīng)產(chǎn)生不利影響。

當(dāng)兩個(gè)注射器均完成裝填后，注射泵A 和 注射泵B 將同時(shí)按照預(yù)設(shè)的流量程序運(yùn)行：

注射泵A：輸送低咪唑濃度緩沖液，初始流速為 1mL/min，經(jīng)20分鐘后遞減至0 ml/min（見圖2）。

注射泵B：輸送高咪唑濃度緩沖液，初始流速為 0mL/min，經(jīng)20分鐘后遞增至1mL/min（見圖3）。

圖2 (左)  & 圖3 (右)

通過雙泵協(xié)同控制，鈷重力柱內(nèi)的總流速在梯度運(yùn)行期間始終維持在1mL/min，這樣的流速既能保證標(biāo)簽蛋白的有效洗脫，又可避免對(duì)重力柱超壓（見圖4）。

圖4